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Las células endoteliales derivadas de células madre mesenquimales de la médula ósea aumentan la densidad capilar y aceleran la angiogénesis en el modelo de isquemia de las extremidades posteriores del ratón

Las células endoteliales derivadas de células madre mesenquimales de la médula ósea aumentan la dens

Categoría Tratamientos capilares

2 de Ago, 2020 . Las células madre mesenquimales (MSC) pueden mejorar la perfusión de las extremidades y aumentar la densidad de los vasos en un modelo murino de isquemia de las extremidades posteriores. Pero la baja tasa de injerto de esas células limitó su efecto terapéutico. Las células endoteliales (CE) juegan un papel importante en la neovascularización. Y las MSC pueden diferenciarse en EC in vitro. El objetivo de este estudio es investigar si la diferenciación EC de MSC in vitro antes del trasplante es efectiva para mejorar los resultados terapéuticos en el tratamiento de la enfermedad isquémica en un modelo animal de isquemia murina.

Este estudio revela que después del pretratamiento a corto plazo en el medio inductor de la CE, las MSC inducidas adquieren una capacidad de formación de vasos más fuerte y un efecto terapéutico angiogénico mejorado en el modelo de isquemia murino de la extremidad posterior.

La enfermedad arterial periférica (PAD) es una manifestación clínica de obstrucción de los territorios vasculares que irrigan las extremidades inferiores causadas principalmente por aterosclerosis y, con menos frecuencia, por trastornos inflamatorios y arteriopatías [1]. Se estima que 200 millones de personas en todo el mundo tienen EAP, lo que resulta en una gran carga para la atención médica y la calidad de vida de los pacientes [2]. Cuando la enfermedad se desarrolla en la etapa avanzada llamada isquemia crónica que amenaza las extremidades (CLTI), a menudo conduce a la amputación ya que hay disponibles opciones de tratamiento limitadas. Además, alrededor del 20-30% de los pacientes con CLTI no son elegibles para la revascularización, incluido el bypass quirúrgico y la angioplastia debido a la calcificación severa de las arterias [3]. En pacientes con enfermedad aterosclerótica severa de la circulación arterial nativa, la administración de poblaciones de células que son capaces de activar el programa angiogénico puede dar lugar a la formación de nuevos vasos, por lo tanto, mejorar o restaurar la perfusión de la extremidad afectada [4].

Sin embargo, un obstáculo principal del trasplante de MSC para uso clínico es el bajo injerto y la baja tasa de supervivencia. Un estudio que utilizó MSC derivadas de médula ósea (BM-MSC) para el tratamiento de heridas en ratones normales y diabéticos arrojó un efecto satisfactorio de curación de heridas, aunque el injerto a los 28 días fue del 2,5%, que es extremadamente bajo [9].

Las CE diferenciadas de las células madre pluripotentes inducidas por humanos pueden aumentar la densidad capilar y mejorar la perfusión en un modelo de isquemia de extremidades posteriores de ratón [10]. Las células CD31 + derivadas de la médula ósea humana después del cultivo a corto plazo en medio de células endoteliales tienen un mayor injerto celular y formación de vasos en un modelo de infarto de miocardio de ratón y un modelo de isquemia de las extremidades posteriores que las células no cultivadas [11], lo que sugiere que el potencial terapéutico y la tasa de supervivencia del tallo las células in vivo podrían mejorarse mediante preestimulación in vitro. Las BM-MSC pueden diferenciarse en EC in vitro [8]. Sin embargo, no se ha informado el potencial terapéutico de las CE derivadas de BM-MSC para el tratamiento de enfermedades isquémicas.

Los ratones transgénicos de proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) eran de fondo C57BL / 6 y se compraron en el Laboratorio Jackson (NO. 006567). Los ratones BALB / c se compraron de SPF Biotechnology (Beijing, China). Todos los ratones fueron criados en las instalaciones de cría de animales en el Primer Hospital de la Universidad de Pekín en condiciones específicas libres de patógenos, y todos los estudios fueron aprobados por el Comité de Ética del Primer Hospital de la Universidad de Pekín.

Las células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea (BM-MSC) se obtuvieron de ratones transgénicos EGFP. Se extrajeron aspirados de médula ósea de ratones enjuagando las tibias usando jeringas con agujas de calibre 20. La médula ósea recién aislada se suspendió en un medio con medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) Que contenía 2% de suero fetal bovino (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) Y 1% de penicilina / estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) En una incubadora de CO2 a 37 ° C-5%. El medio de cultivo se actualizó cada 3 días y se eliminaron las células no adherentes. Las células se pasaron al 80% de confluencia. BM-MSC en cada pasaje se analizaron para los marcadores de superficie utilizando citometría de flujo. Todas las células utilizadas en todos los experimentos fueron de los pasajes 12.

Las MSC se cultivaron en el medio inductor que contenía 50 ng / ml de VEGF (PeproTech, Rocky Hill, NJ, EE. UU.), 10 ng / ml de bFGF (PeproTech, Rocky Hill, NJ, EE. UU.), 20 ng / ml de IGF (PeproTech, Rocky Hill , NJ, EE. UU.), 5 ng / ml de EGF (PeproTech, Rocky Hill, NJ, EE. UU.), Ácido ascórbico, heparina y 2% de FBS. El medio se cambió cada 2 días. El proceso de diferenciación se controló de cerca con la morfología celular. Para confirmar el fenotipo endotelial, las células inducidas se analizaron en busca de marcadores específicos de EC usando una serie de experimentos después de 7 días de cultivo.

La calidad de las MSC se garantizó midiendo las células positivas para EGFP usando citometría de flujo. Las MSC se tiñeron con CD44-APC / Cy7 (Dakewe Biotech Co., Ltd.), CD34-Violet 421 (Dakewe Biotech Co., Ltd.), CD31-PE (Dakewe Biotech Co., Ltd.) y CD29-Percp (Dakewe Biotech Co., Ltd.). Identificamos MSC como células positivas para CD29 y CD44, pero negativas para CD31 y CD34. Después de cultivar BM-MSC en medio inductor durante 7 días, las MSC inducidas se tiñeron con CD31-PE para detectar la expresión del marcador endotelial específico.

Las MSC inducidas que crecieron hasta 80% de confluencia en placas de 24 pocillos se lavaron dos veces con un medio sin suero antes de 10 g / ml de lipoproteína de baja densidad acetilada marcada con Dil (Dil-Ac-LDL) (Sigma Chemicals, St Louis, MO ) fue añadido. Después de incubarse a 37 ° C y 5% de CO2 durante 4 h, la capa celular se lavó en PBS dos veces, luego las células se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 30 minutos. Los núcleos se tiñeron con 4 ', 6-diaminido-2-fenilindol (DAPI) (Zsbio, Beijing, China) antes de que las células se observaran y formaran imágenes bajo un microscopio fluorescente.


Fuente: stemcellres.biomedcentral.com



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